向日葵為什么總是向著太陽？在植物體內有一種稱為生長素的物質，如同人體內生長激素一樣，它負責給細胞傳達信息，指揮植物的生長發(fā)育。受光照影響，生長素會從向日葵莖端向光側運輸?shù)奖彻鈧龋a生濃度差異。由此，背光側生長會更快一些，而向光側慢一些，向日葵的花盤自然就朝向太陽。

生長素的運輸需要細胞膜上的“搬運工”——轉運蛋白的協(xié)助，其中非常重要的一員是負責將生長素從細胞內搬運到細胞外的PIN家族蛋白。這些“搬運工”長什么樣？又是如何工作？

8月2日，《自然》雜志上以“快速通道”形式發(fā)表了中國科學技術大學生命科學與醫(yī)學部孫林峰教授團隊在植物生長機理上的重大進展，揭示了生長素“搬運工”成員PIN1蛋白，以及它分別與抑制劑NPA（又名抑草生）、生長素IAA結合的三個高分辨率結構，并通過功能分析闡釋了PIN1“搬運”生長素的機制，為理解植物生長素運輸調控以及針對PIN家族蛋白的農業(yè)用除草劑和生長調節(jié)劑的設計開發(fā)提供了重要基礎。

擬南芥PIN1蛋白三種狀態(tài)下的結構和轉運機制示意圖 課題組供圖

中國科大生命科學與醫(yī)學部孫林峰教授團隊部分成員合影 代蕊 攝

亟待解決的科學問題

作為第一個被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長素幾乎參與了植物生長發(fā)育調控的每個過程，如胚胎發(fā)育、向光性和向重力性生長等。生長素一個顯著特點是其細胞間傳遞具有方向性，被稱為極性運輸，而PIN家族蛋白在其中發(fā)揮了關鍵作用。

特定PIN家族成員在細胞質膜上具有不對稱分布的特點，它們的分布位置決定了生長素“搬運”的方向。但是由于缺乏精細的三維結構，PIN家族蛋白特異性識別、轉運生長素的機制一直未知。

NPA是之前在實驗室廣泛應用的一種生長素極性運輸抑制劑，也是農業(yè)生產中最早作為除草劑應用的化學小分子之一。它可以直接靶向PIN家族蛋白，但是如何發(fā)揮作用的機制尚不清楚。

孫林峰教授在實驗室 代蕊 攝

孫林峰表示，解析PIN家族蛋白的三維結構是生長素研究領域亟待解決的科學問題。該結構的揭示，不僅有助于理解生長素的“搬運”過程，同時基于這些結構，有利于研究人員針對PIN家族蛋白設計小分子抑制劑，找到更高效、對環(huán)境更友好、對人類更安全的除草劑和生長調節(jié)劑，應用于農業(yè)生產。

此次研究中，孫林峰團隊選擇了PIN家族中經典的，也是最早鑒定出的PIN家族成員之一——擬南芥PIN1蛋白作為研究對象。

成功揭示PIN1蛋白結構

“第一步，我們需要證實PIN1蛋白確實可以運輸生長素。”孫林峰說，團隊花了一年多時間，搭建出一套全新的、基于放射性同位素的功能檢測體系，驗證了PIN1蛋白的生長素“搬運”活性，以及受激酶激活、被NPA抑制的過程。

第二步，表達和純化PIN1蛋白。“簡單來說，就是需要獲取足量的適于結構解析的蛋白樣品。”孫林峰說，這是最難的一步，因為PIN1蛋白在植物體內含量非常低，不能滿足實驗過程中研究量的需求，因此需要借助于其他細胞表達系統(tǒng)，對蛋白進行富集。

孫林峰教授在指導團隊 代蕊 攝

事實上，從2017年建立起團隊，開始這項課題研究，一直到2021年，前四年的時間里，他們一直在摸索不同表達和純化、冷凍樣品制備等條件。

“當時，我們每天很早就到了實驗室，開始一天的工作。我們希望早點優(yōu)化得到性質較好的蛋白，加快實驗進度，所以經常忙的連水都顧不上喝。”論文第一作者、中國科大生命科學與醫(yī)學部博士研究生楊智森說，最終利用哺乳動物表達體系成功獲得了優(yōu)質樣品。

第三步，利用冷凍電鏡單顆粒重構技術解析蛋白結構。“冷凍電鏡相當于蛋白分子的‘攝影師’，可以從不同角度給蛋白‘拍照’，然后利用這些二維照片重構出三維結構”，孫林峰作了一個類比。

“冷凍電鏡數(shù)據收集借助了中國科大冷凍電鏡中心和中科院生物物理所生物成像中心提供的優(yōu)秀平臺，其中中國科大冷凍電鏡中心的300kV高端電鏡是2019年開始安裝，2020年正式投入運行，為我們結構研究提供了‘利器’”，孫林峰說道。

但是PIN1蛋白“不穩(wěn)定”，并且分子量較小。如何使它們“變大”并保持一種相對靜止的狀態(tài)？團隊與中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心李典范團隊合作，篩選得到了靶向PIN1蛋白的納米抗體，并首次揭示了經典PIN家族蛋白成員的三維結構。

一輪審稿人“恭喜”團隊

在這項研究中，團隊又進一步解析出了PIN1與生長素IAA、抑制劑NPA結合的復合體結構，揭示了PIN1蛋白如何“裝載”生長素，以及NPA“鳩占鵲巢”阻制生長素“搬運”的全貌。

在以上研究的基礎上，團隊利用搭建的功能檢測體系，驗證了結構上發(fā)現(xiàn)的一些重要氨基酸位點發(fā)揮的作用，并提出了PIN家族蛋白運輸生長素的模型。

孫林峰教授和高永翔工程師在300kV電鏡上樣間轉移樣品 代蕊 攝

從2017年團隊成立并開始這項課題研究到2022年在《自然》雜志上發(fā)表論文，整五年的時間過去了。“這期間，我們經過了無數(shù)次失敗的嘗試，好在學生和我們都沒有放棄。”孫林峰說。

相比于研究過程，論文投稿還算比較順利。“今年1月份我們向《自然》雜志投稿，2月份就收到第一輪評審意見。”孫林峰說，這個速度在投稿中算比較快，并且評審人都給予了正面的評價。

第一位審稿人評價：“我們應該恭喜作者們獲得這一系列PIN1蛋白的重要結構。在植物生理學領域，生長素運輸?shù)闹匾圆谎远鳎髡邆儷@得的這一系列結構對于我們理解生長素IAA如何被PIN識別和轉運做出了重要貢獻”。

第二位審稿人評價：“這一研究是開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，是從事生長素運輸研究的同仁們翹首以盼的成果”。

遵照審稿人意見，6月份團隊又投回了修改版本；再經過一輪“精雕細琢”后，7月25日被《自然》正式接收。

孫林峰表示，下一步，團隊將繼續(xù)研究PIN1蛋白的動態(tài)轉運過程，捕捉不同狀態(tài)下的三維結構，并進一步研究PIN1蛋白受磷酸化激活及調控的機理，更深入的理解PIN家族蛋白運輸生長素的機制。同時，基于三維結構設計、篩選化學小分子，力圖發(fā)現(xiàn)更安全有效的除草劑或植物生長調節(jié)劑，更好地服務農業(yè)生產。

相關論文信息： https://www.nature.com/articles/s41586-022-05143-9